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(urgent!!!) culture cellulaire d'insectes et l'influence du cadmium (CdCl2) et sérum (svf)

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Message par longicorne le Mar 23 Avr 2013 - 10:19

bonjour a tous besoin d'une petite aide
- tout d'abord je pose les condition du tp

-travaux pratiques sur l'utilisation d'une culture cellulaire d'insectes
l'ensemble de ces expériences est réalisé sur des cellules S2, lignée cellulaire d'insectes. ces cellules se cultivent en milieu de schneider et nécessitent un passage (repiquage) au 1/10 toutes les quatre jours

-objectif du TP : déterminer et comparer in vitro l'influence du cadmium (CdCl2= chloride de cadmium) et sérum (svf= sérum de veau fœtal) sur la croissance et la viabilité des cellules S2
_2 plaques de culture comportant 6 puits pour tester les effets de la concentration du SVF et du CdCl2
plaque SVF(%): 0% de svf , 1% de svf , 2% de svf, 5% de svf, 10% de svf et 20% de svf
plaque cdcl2 (microM) avec 10% de svf: 0microM, 10, 20, 50, 100, 200

protocole
1er jours vendredi 12 Avril
- ensemencement cellulaire:
A-décollement cellulaire
-enlever le milieu de culture du flask et le remplacer par 5ml de milieu de schneider
-décoller les cellules par des jets successifs de milieu de culture (pipette de 5ml en verre stérile à bout recourbé...)
B-comptage cellulaire
-poser la lamelle sur la cellule de malassez
-homogénéiser la suspension cellulaire par pipetages doux et prélever un petit volume (100microlitre) de (milieu + cellules) à placer entre la cellule de malassez et la lamelle jusqu'à remplir complétement l'espace
-observer au micoscope et compter les cellules dans 25 carreaux doublement quadrillés
-déterminer le titre de la suspension cellulaire (cellules/ml) sachant qu'un carreau a un volume de 10^-5ml
C-ensemencement des plaques après préparation de la suspension cellulaire: 30ml de suspension à 200 000 cellules/ml par hotte (pour 2 binômes)
-ensemencement des 2 plaques 6 puits (svf et cdcl2) avec 1ml de la suspension cellulaire
-préparation les solutions de svf
pour 2 binômes:

solution, concentration en svf(%), svf(microlitre ou ml ), milieu schneider(ml),
SA, 0% (svf%), 0microlitre (svf microlitre ou ml), 2.5ml (schneider)
SB, 2%(svf%), 50microlitre (svf microlitre ou ml), 2.47ml(schneider)
SC, 4%(svf%), 100microlitre(svf microlitre ou ml), 2.4ml(schneider)
SD, 10%(svf%), 250microlitre(svf microlitre ou ml), 2.25ml(schneider)
SE, 20%(svf%), 3.2ml (svf microlitre ou ml) , 12.8ml(schneider)
SF, 40%(svf%), 1.2ml(svf microlitre ou ml), 1.8ml(schneider)


-pour la plaque SVF: ajouter à chaque puits 1ml d'une solution de SVF préparées pour obtenir la concentration finale de SVF à tester (réalisation en pratique d'une dilution au 1/2)
-pour plaque Cdcl2: ajouter dans tous les puits 1ml de la solution SE (réalisation en pratique d'une dilution au 1/2)
-refermer les plaques SVF et CdCl2 et les placer dans incubateur à 27°C pour 1 semaine

jeudi 18avril réalisé par prof:
supplémentation en cadmium (228.36g/mol)
-préparer des solutions mères de cdcl2 à 10^-1 M et 10^-3M
solution cdcl2 à 10^-1 M peser 44mg à dissoudre dans 2ml d'eau
solution cdcl2 à 10^-3M: 60microlitre de cdcl2 à 10^-1M + 5940microlitre milieu schneider
-préparer solution de cdcl2 à tester:
ajouter dans l'ordre 20 microlitre, 40, 100, 200, 400 de cdcl2 à 10^-3M dans les puits de 10 microM, 20, 50, 100, 200 contenant 2ml de milieu
placer la plaque Cdcl2 dans incubateur à 27°C

vendredi 19 avril
comptage et viabilité cellulaire
plaque svf nbr tot de cellules nbr de cellules vivantes Nbre cellules morte
puits1- 0%
puits2- 1%
puits3- 2%
puits4- 5%
puits5- 10%
puts6- 20%


plaque cdcl2 nbr tot de cellules nbr de cellules vivantes Nbre cellules morte
puits1- 0microM
puits2- 10microM
puits3- 20
puits4- 50
puits5- 100
puts6- 200

-décoller donc les cellules grâce à pipette p1000 par jets de milieu sur le tapis cellulaire
-prélever et transferer 100microlitre de solution cellulaire de chaque puits et ajouter 100 microlitre de bleu de tryptan et aussi 350microlitre de PBS
le bleu est pour voir les cellules vivantes ou mortes (bleu si morte et translucide si vivante)
-réaliser le comptage cellulaire à l'aide d'une cellule de malassez

résultat
(les résultat montre que les cellules avec du SVF seul vivent il y a augmentation du nb de cellule/ml et peut de pourcentage de mort avec concentration qui augmente, il baisse
pour le cdcl2 il semble y avoir une stagnation du nb de cellules par ml pas vraiment de croissance mais le pourcentage de mort augmente avec la concentration qui augmente)


Donc voici mes questions
j'aurais voulus savoir, si vous saviez:
(c'est surtout pour les questions 1 et 2 que j'ai besoin d'aide)
1-quels sont les différents intérêts d'utilisés des tests de croissance et viabilité cellulaire (comme celui-ci dans notre protocole ou dans d'autre expériences) ?
2-dans quels autres types d'études peut-être envisageable avec ce modèle (culture cellulaire d'insectes car on utilise celui-ci dans notre expérience, je pense que c'est celui ci le modèle ) il faut donner plusieurs possibilités

(pour question 3 et 4 que si vous savez me répondre)
3-que contient le milieu de schneider ou qui est-il et pourquoi utilise t-on celui-ci pour faire pousser les cellules S2?.
4-que sont les cellules S2 (tout ce que je sait ce sont des cellules embryonnaires de drosophile) et pourquoi utiliser celle ci?


Dernière édition par longicorne le Mer 24 Avr 2013 - 8:46, édité 1 fois

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Message par longicorne le Mer 24 Avr 2013 - 7:51

un petit up svp

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